菌株基因編輯

菌株基因編輯作為新型科技方式不斷得到發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)種質(zhì)改良、藥物開發(fā)、能源生物技術(shù)等領(lǐng)域。它的出現(xiàn)和發(fā)展，使得相關(guān)行業(yè)得以取得新的突破和發(fā)展。咨詢電話:13816144967(微信同號)

菌株基因編輯的最大原理是可以提供精確的編輯方式，將宿主體內(nèi)的DNA序列精確操控。通過"剪切切割酶"對菌株的基因中的目標(biāo)的基因進(jìn)行分割，然后再由"基因組封裝器"進(jìn)行重組，以打開被所需特性的基因。

一、利用同源基因序列的交換的實(shí)驗(yàn)步驟：

一種基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除:首先構(gòu)建同源交換位點(diǎn)(AES)，隨后將其整合到特定菌株噬菌體基因組中，獲得噬菌粒(phasmid);將噬菌粒導(dǎo)入特定菌株，獲得整合有同源交換位點(diǎn)的重組噬菌體，經(jīng)體外擴(kuò)增獲得高滴度的重組噬菌體，對特定菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染;將轉(zhuǎn)染后的特定菌株涂布到含潮霉素抗性的固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 4-5 周，挑取單克隆，通過 PCR 等方式進(jìn)行驗(yàn)證。

主要原理是同源重組的方法，利用同源基因序列的交換將目的基因敲除。

（1）找一個(gè)溫敏型質(zhì)粒；

（2）用PCR方法擴(kuò)增靶向基因兩側(cè)各200bp片段，并要加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)；

（3）篩選一個(gè)合適的抗性基因；

（4）將抗性標(biāo)記連接與兩個(gè)片段的中間，然后與溫敏質(zhì)粒連接；

（5）轉(zhuǎn)入菌株感受態(tài)中；

（6）通過合適的抗性篩選篩選陽性工程菌株。

二、服務(wù)流程：

1.客戶提供敲除基因編號；

2.構(gòu)建同源臂及包裝噬菌體；

3.噬菌體感染菌并驗(yàn)證陽性克??；

4.提交特定菌株基因敲除菌株（液體）及實(shí)驗(yàn)相關(guān)的引物、測序結(jié)果、詳細(xì)的結(jié)題報(bào)告。

服務(wù)周期4-6個(gè)月。

三、基于CRISPR/Cas9平臺的菌基因組改造實(shí)驗(yàn)步驟：

CRISPR/Cas9是一種在特定目標(biāo)位置切割DNA的工具，Cas9蛋白可在sgRNA的引導(dǎo)下對特定基因進(jìn)行剪切，從而達(dá)到基因敲除、敲入以及修飾、調(diào)控等目的。

敲除：與常規(guī)的shRNA敲除不同，CRISPR/CAS9和sgRNA可特異性的在基因組水平造成堿基的缺失或插入（INDEL），造成原有基因表達(dá)框的破壞，造成靶基因蛋白水平的完全敲除。

敲入：與常規(guī)病毒介導(dǎo)的表達(dá)不同，CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因組位點(diǎn)切割后，可在帶有同源臂的修復(fù)模板引導(dǎo)下，將待敲入的基因插入到目的位點(diǎn)，不同于病毒介導(dǎo)的隨機(jī)整合。咨詢電話:13816144967(微信同號)